Závěrečné práce studentů

RNDr. Veronika Benson, Ph.D.

PCR (polymerázová řetězová reakce) je rychlou a spolehlivou metodou umožňující kvalitativně nebo kvantitativně vyhodnotit specifickou RNA ve vzorku.PCR využívá různých přístupů, hlavními je využití specifické TaqMan sondy nebo nespecifická detekce pomocí barvičky SybrGreen. Efektivita a citlivost detekce záleží na použité reakční směsi, které se neustále vyvíjí. Cílem práce bude otestovat a porovnat různé způsoby detekce nukleových kyselin a zjistit, zda je některý z přístupů vhodný pro detekci málo exprimovaných mRNA případně pro detekci nekódujících RNA. Jako zdroje RNA využijeme lidské linie pěstované in vitro a izolaci RNA pomocí afinitních kolonek a centrifugace. RNA bude detekována pomocí specifických primerů a přístroje PCR v reálném čase, který umožňuje relativní kvantifikaci. Výstupem bude zhodnocení různých detekčních přístupů pro kvantifikaci RNA.

Tkáňové kultury představují hlavní modelový system pro hodnocení bezpečnosti a účinnosti nových látek a materiálů. Pro jejich růst se používají plasty se speciální povrchovou úpravou. Pro větší flexibilitu experiment v laboratoři by bylo výhodné získat kultivační pomůcky na míru. K tomu by mohlo sloužit jejich vytištění na 3D tiskárně dle požadavků daného experimentu. V další fázi by bylo možné do kultivačních nádob tisknout přímo živé buňky a vytvořit tak vysoce specializované modely. Cílem bakalářské práce bude navrhnout a vytisknout na 3D tiskárně inzert do kultivačních jamek a zhodnotit jeho bezpečnost pro použití s tkáňovou kulturou. Pro tisk kultivačního povrchu bude použit biokompatibilní polymer např. kyselina polymléčná. Návrh produktu bude přizpůsoben klasickým kultivačním jamkám, které se používají pro hodnocení toxicity materiálů. Vytištěný inzert bude osazen kulturou lidských buněk (např. osteoblasty nebo keratinocyty) a bude zjištěna jejich viabilita. Pokud bude metodicky možné, využijeme dale 3D tiskárnu pro biotisk lidských kožních buněk na kultivační mističku. Výstupem bude zhodnocení využití 3D tiskárny pro inovaci laboratorních modelů tkáňových kultur. 

Nekódující RNA, např. microRNA, jsou krátké úseky RNA, které kontrolují všechny buněčné procesy. Jsou to tedy velmi důležité molekuly a změny v jejich hladině vedou k různým patologickým stavům. Proto jsou take v současné době často využívány jako markery onemocnění. Pro jejich zpracování je potřeba znát koncentraci krátkých RNA ve vzorku. Protože jsou pouze 21 bp dlouhé, není možné je detekovat pomocí klasického spektrometru při vlnové délce 260 nm, tak jako klasickou mRNA. K jejich detekci se využívá speciální spektrometr Qubit se svou reakční směsí, Qubit (kombinace absorbance a fluorescence, detekce v malém objemu). Cílem bakalářské práce je zavést a optimalizovat metodu detekce krátkých RNA pomocí fluorescenčního spektrometru Tecan a reakční směsi Qubit. Zdrojem krátkých RNA budou lidské buněčné linie. K izolaci krátkých RNA využijeme afinitní kolonky a centrifugaci. Spektrometr Tecan, který je nově na oddělení VBA umožňuje vedle absorbance i měření fluorescence a je tedy vhodným přístrojem pro optimalizaci detekce za použití chemie Qubit. Výsledky měření na stroji Tecan budou porovnány s výsledky získanými z přístroje Qubit. Výstupem bude optimalizovaná metodika detekce krátkých RNA ve vzorcích z lidských buněk.

Mykoplazmy představují problematickou kontaminaci tkáňových kultur. Tkáňové kultury se používají pro zhodnocení bezpečnosti a účinnosti léčiv, hodnocení biocompatibility materiálu a další základní I aplikovaný výzkum. Aby byly výsledky opakovatelné a věrohodné, je potřeba mít tkáňové kultury čisté. Cílem práce bude zavedení a optimalizace metody detekce mykoplazmy v tkáňové kultuře. Pro detekci mykoplazmy využijeme polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a specifické primery. PCR budeme provádět pomocí SybrGreen barvičky, která se interkaluje do nukleové kyseliny a emituje fluorescence. Kvantifikaci mykoplazmy potom budeme hodnotit pomocí PCR v reálném čase a relativní kvantifikace. Pokud bude metodicky možné, porovnáme citlivost detekce PCR a citlivost fluorescenční mikroskopické analýzy (po obarvení nukleové kyseliny pomocí DAPI) přímo v kontaminované kultuře. Výstupem bude optimalizovaná metodika detekce mykoplazmy v tkáňové kultuře pomocí PCR.